Projetando um novo ponto de apoio para terapêutica de RNA, terapias celulares e diagnósticos

eToeholds são elementos de controle projetados que podem fazer ARN terapêutica mais segura, terapias celulares mais eficazes e permitem novas formas de biodetecção.

Os RNAs são mais conhecidos como as moléculas que traduzem informações codificadas nos genes em proteínas com sua infinidade de atividades. No entanto, devido à sua complexidade estrutural e relativa estabilidade, o RNA também tem atraído grande atenção como um biomaterial valioso que pode ser usado para criar novos tipos de terapias, biomarcadores sintéticos e, claro, vacinas potentes, como aprendemos com o COVID 19 pandemia.

A entrega de uma molécula de RNA sintética a uma célula essencialmente a instrui a produzir uma proteína desejada, que pode então realizar funções terapêuticas, de diagnóstico e outras. Um desafio fundamental para os investigadores tem sido permitir que apenas as células que causam ou são afetadas por uma doença específica expressem a proteína e não outras. Essa capacidade poderia agilizar significativamente a produção da proteína no corpo e evitar efeitos colaterais indesejados.

Agora, uma equipe de biólogos sintéticos e engenheiros celulares liderada por James J. Collins, Ph.D. no Instituto Wyss de Engenharia Biologicamente Inspirada e no Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT), desenvolveu eToeholds – pequenos dispositivos versáteis incorporados no RNA que permitem a expressão de uma sequência codificadora de proteína ligada apenas quando um RNA viral ou específico da célula está presente. Os dispositivos eToehold abrem múltiplas oportunidades para tipos mais direcionados de terapia de RNA, em vitro abordagens de engenharia de células e tecidos e a detecção de diversas ameaças biológicas em humanos e outros organismos superiores. As descobertas são relatadas em Biotecnologia da Natureza.

Em 2014a equipe de Collins, juntamente com a do membro do corpo docente do Wyss Core, Peng Yin, Ph.D., desenvolveu com sucesso interruptores de apoio para bactérias que são expressos em um estado desligado e respondem a RNAs desencadeadores específicos, ativando a síntese de uma proteína desejada pela maquinaria de síntese de proteínas bacterianas. No entanto, o desenho do suporte bacteriano não pode ser utilizado em células mais complexas, incluindo células humanas, com a sua arquitectura e aparelho de síntese de proteínas mais complicados.

“Neste estudo, pegamos elementos IRES (locais internos de entrada do ribossomo), um tipo de elemento de controle comum em certos vírus, que aproveitam o maquinário de tradução de proteínas eucarióticas, e os projetamos desde o início em dispositivos versáteis que podem ser programados para detectar RNAs desencadeadores específicos de células ou patógenos em células humanas, de leveduras e vegetais”, disse Collins. “Os eToeholds poderiam permitir abordagens terapêuticas e de diagnóstico de RNA mais específicas e seguras, não apenas em humanos, mas também em plantas e outros organismos superiores, e ser usados ​​como ferramentas em pesquisa básica e biologia sintética.”

Os elementos de controle conhecidos como “locais internos de entrada do ribossomo”, em resumo, IRESs, são sequências encontradas no RNA viral que permitem que os ribossomos sintetizadores de proteínas da célula hospedeira acessem um segmento do genoma viral próximo a uma sequência que codifica uma proteína viral. Uma vez ligados ao RNA, os ribossomos começam a escanear a sequência que codifica a proteína, enquanto sintetizam simultaneamente a proteína adicionando sequencialmente a sequência correspondente. aminoácidos até o seu fim crescente.

“Projetamos sequências IRES introduzindo sequências complementares que se ligam umas às outras para formar estruturas inibitórias de pares de bases, que impedem o ribossomo de se ligar ao IRES”, disse o co-autor Evan Zhao, Ph.D., que é um Bolsista de pós-doutorado na equipe de Collins. “O elemento de sequência de codificação de loop em gancho em eToeholds é projetado de tal forma que se sobrepõe a sequências de sensores específicas que são complementares aos RNAs desencadeadores conhecidos. Quando o RNA desencadeador está presente e se liga ao seu complemento em eToeholds, a alça em gancho se abre e o ribossomo pode ser ativado para fazer seu trabalho e produzir a proteína.”

Zhao se uniu ao coautor e bolsista de desenvolvimento de tecnologia da Wyss, Angelo Mao, Ph.D., no projeto eToehold, o que lhes permitiu combinar suas respectivas áreas de especialização em biologia sintética e engenharia celular para abrir novos caminhos na manipulação de Sequências IRES.

Em um processo de iteração rápida, eles foram capazes de projetar e otimizar eToeholds que eram funcionais em células humanas e de levedura, bem como em ensaios de síntese de proteínas livres de células. Eles alcançaram uma indução de até 16 vezes de genes repórteres fluorescentes ligados a eToeholds exclusivamente na presença de seus RNAs desencadeadores apropriados, em comparação com RNAs de controle.

“Projetamos eToeholds que detectaram especificamente o Zika vírus infecção e a presença de SARS-CoV-2 RNA viral em células humanas e outros eToeholds desencadeados por RNAs específicos de células como, por exemplo, um RNA que só é expresso em melanócitos da pele”, disse Mao. “É importante ressaltar que os eToeholds e as sequências que codificam as proteínas desejadas ligadas a eles podem ser codificadas de forma mais estável. ADN moléculas, que quando introduzidas nas células são convertidas em moléculas de RNA adaptadas ao tipo de expressão proteica que pretendemos. Isso expande as possibilidades de entrega do eToehold às células-alvo.”

Os pesquisadores acreditam que sua plataforma eToehold poderia ajudar a direcionar terapias de RNA e algumas terapias genéticas para tipos de células específicos, o que é importante, já que muitas dessas terapias são dificultadas por toxicidades excessivas fora do alvo. Além disso, poderia facilitar ex-vivo abordagens de diferenciação que guiam as células-tronco ao longo dos caminhos de desenvolvimento para gerar tipos de células específicos para terapias celulares e outras aplicações. A conversão de células-tronco e células intermediárias ao longo de muitas linhagens celulares diferenciadoras geralmente não é muito eficaz, e os eToeholds podem ajudar a enriquecer os tipos de células desejados.

“Este estudo destaca como Jim Collins e sua equipe na plataforma Wyss Living Cellular Device estão desenvolvendo ferramentas inovadoras que podem avançar no desenvolvimento de terapias celulares e de RNA mais específicas, seguras e eficazes e, assim, impactar positivamente a vida de muitos pacientes, ” disse o Diretor Fundador da Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., que também é o Judah Folkman Professor de Biologia Vascular na Harvard Medical School e no Boston Children's Hospital, e professor de bioengenharia na Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

Para obter mais informações sobre este estudo, consulte Interruptor de controle de RNA: engenheiros desenvolvem uma maneira de ativar seletivamente terapias genéticas em células humanas.

Referência: “Elementos responsivos ao RNA para controle translacional eucariótico” por Evan M. Zhao, Angelo S. Mao, Helena de Puig, Kehan ​​Zhang, Nathaniel D. Tippens, Xiao Tan, F. Ann Ran, Isaac Han, Peter Q. Nguyen , Emma J. Chory, Tiffany Y. Hua, Pradeep Ramesh, David B. Thompson, Crystal Yuri Oh, Eric S. Zigon, Max A. English e James J. Collins, 28 de outubro de 2021, Biotecnologia da Natureza.
DOI: 10.1038/s41587-021-01068-2

Outros autores do estudo são Helena de Puig, Ph.D., Kehan ​​Zhang, Ph.D., Nathaniel Tippens, Ph.D., Xiao Tan, MD, F. Ann Ran, Ph.D., Wyss Research Assistant Isaac Han, Peter Nguyen, Ph.D., Emma Chory, Ph.D., Tiffany Hua, Pradeep Ramesh, Ph.D., Cientista da equipe da Wyss David Thompson, Ph.D., Crystal Yuri Oh, Eric Zigon e Max English . O estudo foi financiado por doações da BASF, do NIH (sob a concessão #RC2 DK120535-01A1) e do Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering.